方案优势

用HPLC-ELSD法对复方甘草酸铵注射液中未衍生的甘氨酸、盐酸半胱氨酸进行直接测定，结果较满意。

采用标准

现行标准中采用容量法分别测定盐酸半胱氨酸与甘氨酸含量，但在实际检验中，该方法操作繁琐，干扰因素多，误差较大。现在氨基酸的含量一般都采用柱前衍生化RP-HPLC法测定心引，由于柱前衍生化反应溶液量较少，试剂容易挥发，衍生化时间较长，致使试验条件不易控制；同时衍生物是否具有足够的稳定性也需要考察，这些因素的限制使该法不利于直接、快速测定氨基酸。

方法/原理/步骤

　　测试过程：

　　色谱条件

　　C18—ODL色谱柱(4.6 mm×250mm，5μm)；流动相A(乙腈)-B(5.0 mmol/L七氟丁酸的0.7%三氟醋酸溶液)，流动相A与流动相B梯度洗脱(0-5 min，0：100；5-10 min，15：85；10-25 min，35：65)；ELSD漂移管温度80℃(氮气流量2.0 L·min-1，流速0.8 mL·min-1，柱温35℃，进样量10μL，理论塔板数按甘氨酸峰计不低于3000。

　　对照品溶液制备

　　分别精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的甘氨酸对照品97.15mg、盐酸半胱氨酸对照品7.72mg，置10mL量瓶中，加0.01mol/L盐酸溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1mL置10mL量瓶中，加0.01mol/L。盐酸溶解并稀释至刻度，摇匀，即得含甘氨酸0.9715g/L、盐酸半胱氨酸0.0772g/L的对照品溶液。

　　供试品溶液制备

　　取本品1mL，移置20mL量瓶中，加0.01 mol/L。1盐酸稀释至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，备用。

　　阴性样品溶液制备

　　取缺甘氨酸、盐酸半胱氨酸的样品，按供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。

　　空白试验

　　为进一步确定方法的可行性，取阴性样品溶液，依法测定，结果阴性样品溶液色谱在与混合对照品峰相应的保留时间处无色谱峰，表明无干扰，色谱图见图1。

　　图1复方甘草酸铵注射液HPLC色谱

　　线性关系考察

　　分别取上述对照品溶液5，10，15，20，25，30μL进样，按上文的条件与方法进样测定，以对照品的6个进样量对数值x为横坐标，以峰面积对数值y为纵坐标，进行线性回归，甘氨酸回归方程为y=1.351X+4.272(r=0.997 5)，线性范围4.858～29.145μg；盐酸半胱氨酸回归方程为y=1.723X+8.911(r=0.995 2)，线性范围0.386～2.316μg。

　　精密度试验取对照品溶液，重复进样5次，测定峰面积，甘氨酸RSD 1.97%，盐酸半胱氨酸RSD 1.04%。

　　稳定性试验

　　取同一批供试品溶液，室温下放置，分别于0，2，4，8，12 h测峰面积，甘氨酸峰面积12 h内RSD 2.53%，盐酸半胱氨酸峰面积12 h内RsD 2.21%，说明甘氨酸与盐酸半胱氨酸在0.01 m01.L“盐酸中稳定。

　　重复性试验

　　取同一批样品5份，制成供试品溶液，分别测定峰面积，利用标准曲线计算，甘氨酸与盐酸半胱氨酸RSD分别为1.95%，2.07%。

　　回收率试验

　　取已知含量的样品(批号11041802，甘氨酸19.81 g·L～、盐酸半胱氨酸1.466g·L。1)6份，每份0.5 mL，分别移置20 mL量瓶中，每份各精密加入对照品溶液1 mL(浓度为甘氨酸9.826 g·L～，盐酸半胱氨酸0.747 g·L)，制成供试品溶液，分别测定。计算回收率，结果甘氨酸与盐酸半胱氨酸平均回收率分别为97.43%，96.99%；RSD分别为1.61%，1.89%。见表1～2。

　　表1 氨酸加样回收率试验

　　表2 盐酸半胱氨酸加样回收率试验

　　样品含量测定取复方甘草酸铵注射液3批(11041802，11041803，11041804)，制成供试品溶液，分别测定。计算含量，结果3个批号的样品含甘氨酸分别为19.81，19.49，19.58 g/L，含盐酸半胱氨酸分别为1.466，1.471，1.449 g/L。

仪器设备

　　仪器与试药

　　兰博series 4060高效液相色谱仪

　　另外还有兰博蒸发光散射检测器(Ezchrom色谱管理软件，美国lanbo公司)，电子天平，真空恒温干燥箱，自动双重纯水蒸馏器。甘氨酸对照品、盐酸半胱氨酸对照品；三氟乙酸七氟丁酸，色谱纯乙腈，重蒸馏水，其余试剂为分析纯。复方甘草酸铵注射液、缺甘氨酸、盐酸半胱氨酸样品。

讨论:

　　方甘草酸铵注射液质量标准H1规定用氯化溴滴定法测定盐酸半胱氨酸含量，试验要求加入1mol/L的盐酸2 mL，静置后生成白色沉淀，此凝乳状沉淀使溶液黏稠，导致下一步过滤困难。亚硫酸钠若去除不彻底，也会干扰检验结果，实践中发现用该法含量测定结果偏高。

　　大部分氨基酸分子中无共轭结构，无紫外吸收或较弱，所以不能直接用紫外检测器检测，只能通过适当衍生化后产生有紫外吸收的衍生物，方可用紫外检测器或荧光检测器检测哺。现在常用的氨基酸柱前衍生法根据衍生化试剂不同有PITC法、AQC法、OPA.FMOc法和DNFB等法。这些方法本身要求反应选择性强、定量进行，衍生物有足够的稳定性，但笔者通过试验发现的OPA-半胱氨酸和DNFB-半胱氨酸衍生物均不稳定，使用这两种方法测半胱氨酸含量时误差较大。采用蒸发光散射检测器检测则可省去衍生化这一步骤，试验时间大大缩短。

　　ELSD检测器作为一种准通用型检测器，仅对不挥发被分析物产生信号，其信号响应值仅取决于被分析物质颗粒的大小和数量，而不需考虑有无紫外吸收的问题，该检测方法对流动相的变化不敏感，即使在梯度洗脱时基线也很平稳。通过调节ELsD检测器的漂移管温度与载气流速，可以使基线噪音最小，响应值相对最高，从而获得很好的色谱图。本研究中考察了漂移管温度70，80，90℃，气体流速1.8，2.0，2.2 L/min。1条件下的色谱情况，结果选定漂移管温度80℃，气体流速2.0 L/min。为试验条件，该条件下基线平稳，噪音小，被测成分均有适宜的响应值。

　　氨基酸在水溶液中为强电解质，在极性溶剂中溶解度较大，在极性较弱的c18柱上保留时间非常短。七氟丁酸可与氨基酸分子形成离子对，抑制了氨基酸的解离，适当延长了保留时间，改善了峰型。本研究采用乙腈5.0 mmol/L的七氟丁酸-0.7%三氟乙酸系统，甘氨酸和半胱氨酸分离完全，色谱峰型对称性好、峰形尖锐，保留时间适当。试验全过程操作简便，结果准确、可靠，可用于该制剂的质量控制。